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Peau – Planches Histologiques

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Planches – Planches Histologiques

Journées du Collège 2006 – Tours – 16-18 Mars – Intérêt pronostique de l’expression de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT) dans la leucémie lymphoïde chronique (LLC)

Intérêt pronostique de l’expression de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT) dans la leucémie lymphoïde chronique (LLC)- L. Véronèse 1,2 , C. Chaleteix 3 , C. Magnac 4 , Y. Vasconcellos 4 , F. Davi 5 , O. Tournilhac 3 , P. Verrelle 2 , G. Dighiero 4 , P. Vago 1 , P. Travade 3 , A. Tchirkov 1,2 .

1 Service de Cytogénétique Médicale, CHU – Faculté de Médecine, Clermont-Ferrand ; 3 Service d’Hématologie, CHU, Clermont-Ferrand ; 2 EA 3846, Centre Jean Perrin – Faculté de Médecine, Clermont-Ferrand ; 4 Institut Pasteur, Paris ; 5 Hôpital Pitié-Salpêtrière, Paris.

Adresse E-mail de l’auteur correspondant  : lauren_veronese@yahoo.fr

But de l’étude  : La classification clinique de Binet isole bien les formes graves de la LLC mais ne prédit pas l’évolution des stades précoces. L’enjeu est de trouver des facteurs pronostiques prédisant l’évolution des patients en stade A. L’objectif de notre étude était d’évaluer la valeur pronostique de l’expression de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT) dans la LLC.

Matériel et Méthodes : Nous avons quantifié le niveau de l’expression de hTERT dans les lymphocytes sanguins chez 110 patients atteints de LLC. Les résultats ont été corrélés aux stades de Binet, à la survie de patients, et aux facteurs de pronostic de référence, à savoir le statut mutationnel des gènes des chaînes lourdes des immunoglobulines (IgV) et l’expression de CD38.

Résultats  : Nous avons trouvé une relation entre les taux d’expression d’hTERT et le stade de Binet, ceux-ci étant d’autant plus élevés que la maladie est grave. Il existait une corrélation entre la survie et l’expression de hTERT, la survie étant significativement plus courte chez les patients exprimant hTERT. Le niveau d’expression de hTERT était augmenté de façon significative dans les formes de mauvais pronostic présentant les gènes IgV non mutés et CD38-positives. Ces corrélations ont été retrouvées dans la population globale et dans les stades A.

Conclusions  : Ces données suggèrent que hTERT puisse être utilisée comme marqueur pronostique de la LLC. La quantification de l’expression de hTERT est une méthode facilement utilisable en pratique clinique grâce au développement de nouvelles technologies de PCR en temps réel.

Journées du Collège 2006 – Tours – 16-18 Mars – Etude de la Biogénèse mitochondriale et du métabolisme mitochondrial sur des modèles tumoraux de cellules CRCC ET U937

ETUDE DE LA BIOGENESE MITOCHONDRIALE ET DU METABOLISME MITOCHONDRIAL SUR DES MODELES TUMORAUX DE CELLULES CRCC ET U937 – V. Jahnke (1) , D. Boudard (2 ) , O. Sabido (3) , E. Hervouet (4) , D. Guyotat (2) , C. Godinot (4) et D. Freyssenet (1) .

(1) Unité Physiologie et Physiopathologie de l’Exercice et Handicap EA3062, Université Jean Monnet, Saint-Etienne; (2) Unité Adhérence et Survie cellulaire dans les cancers et les greffes, Université Jean Monnet, Saint-Etienne EA3063 ; (3) Centre Commun de Cytométrie en Flux, Université Jean Monnet, Saint-Etienne ; (4) UMR5534 CNRS, Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne.

Objectif. La modulation de la respiration mitochondriale et l’induction de la biogenèse mitochondriale participent au contrôle de la prolifération cellulaire. Notre étude a pour objectif de déterminer l’importance fonctionnelle de la biogenèse mitochondriale et du métabolisme mitochondrial dans le processus de prolifération tumorale.

Matériels et méthodes. Quatre modèles cellulaires ont été utilisés en binôme : 1) une lignée de carcinome à cellules claires rénales invalidées pour le gène VHL (CRCC/VHL-) et une lignée de cellules témoins non déficientes pour ce gène (lignée CRCC/VHL+), 2) ainsi qu’une lignée leucémique monoblastique (U937) et des lymphocytes périphériques normaux. Pour chaque type cellulaire, la biogenèse mitochondriale et le métabolisme mitochondrial ont été analysés sur cellules vivantes (exclusion du Iodure de Propidium) en fonction des différentes phases du cycle cellulaire (Hoechst 33342). La biogenèse mitochondriale a été étudiée par l’analyse du contenu en mitochondries (nonyl acridine orange, NAO)  et par l’étude de l’expression de divers marqueurs spécifiques [immunodétection du peroxisome proliferator activated (PPAR- a et PPAR- b / d ), du PPAR- a co-activator (PGC-1 a ), et de la nitric oxide synthase (NOS1)]. Le métabolisme mitochondrial a été analysé par l’étude : 1) du potentiel transmembranaire mitochondrial (? Y m) (D-273 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide, DiOC6), 2) du potentiel transmembranaire mitochondrial / contenu mitochondrial (ratio Tetramethylrhodamine Ethyl Ester, perchlorate, TMRM / NAO ), et 3) de la production d’espèces oxygénées réactives (ROS) ( 2′ , 7′-DichloroDihydroFluorescein Diacetate, DCFH2DA).

Résultats. Biogenèse mitochondriale. Dans les cellules VHL+ et VHL-, nous avons observé une augmentation significative et similaire de la masse mitochondriale (+ 50%) au cours du cycle cellulaire. Parallèlement, nous avons noté entre G0/G1 et G2+M une augmentation significative de l’ensemble des marqueurs de la biogenèse mitochondriale, avec cependant une augmentation de l’expression des PPARs supérieure pour les cellules VHL+ (p<0,001). Une augmentation significative de l’expression des marqueurs de la biogenèse mitochondriale au cours du cycle cellulaire a été également retrouvée pour les cellules U937 (p < 0,001). L’analyse des contrôles lymphocytaires est en cours.

Métabolisme mitochondrial. Nous avons observé une augmentation significative du ? Y m (+ 40%) entre les phases G0/G1 et G2+M, à la fois dans les cellules VHL+ et VHL-. L’analyse du ratio TMRM/NAO a révélé une augmentation significative de la respiration cellulaire par « unité mitochondriale », avec cependant une augmentation inférieure dans les cellules VHL- (p<0,05). Enfin, nous avons noté dans les cellules VHL+ et VHL- une augmentation similaire de la production de ROS au cours du cycle cellulaire (+ 55%, p<0,001), malgré une respiration mitochondriale différente. Ces résultats montrent que le métabolisme mitochondrial est différent entre ces deux types cellulaires. Concernant les cellules U937, une évolution comparable du ? Y m (+ 30%, p<0,001) et de la production de ROS (+ 38%, p<0,001) a été observée entre les phases G0/G1 et G2+M, tandis qu’une faible augmentation du signal TMRM/NAO a été obtenue (+7%, p<0,01). Les résultats des contrôles lymphocytaires sont en cours d’analyse.

Discussion / Conclusion. Les données obtenues montrent que les niveaux d’expression des différents marqueurs de la biogenèse mitochondriale au cours du cycle cellulaire sont corrélés à l’évolution du contenu mitochondrial dans les cellules VHL+ et VHL-, même si le niveau d’expression des PPARs est plus faible dans les cellules VHL-. Malgré un contenu mitochondrial comparable, les cellules VHL+ et VHL- présentent donc un métabolisme mitochondrial différent. La signification fonctionnelle de cette différence reste à déterminer.

Perspectives. Nous souhaitons maintenant rechercher l’existence de relations moléculaires entre le contenu et le métabolisme des mitochondries et le niveau de résistance à l’apoptose de ces modèles cellulaires.

Journées du Collège 2006 – Tours – 16-18 Mars – L‘intégrine a6b1 spermatique est impliquée dans le processus de fusion gamétique chez la souris – Barraud-Lange V. 1 , Naud-Barriant N. 1 , Ziyyat A. 1 , Wolf JP. 1

L‘intégrine a6b1 spermatique est impliquée dans le processus de fusion gamétique chez la souris – Barraud-Lange V. 1 , Naud-Barriant N. 1 , Ziyyat A. 1 , Wolf JP. 1

Laboratoire de Biologie de la Reproduction , UFR SMBH, Université Paris 13, 74, rue Marcel Cachin, 93017 Bobigny, France. Service d’Histologie-Embryologie-Cytogénétique, Hôpital Jean Verdier (Assistance Publique-Hôpitaux de Paris), Bondy, France. ( jean-philippe.wolf@jvr.ap-hop-paris.fr ).

La fécondation résulte de la fusion des membranes du spermatozoïde et de l’ovocyte suivie de la pénétration de son noyau dans l’ooplasme. Cette fusion des membranes présente des analogies moléculaires importantes avec le mécanisme de la fusion des virus avec les cellules épithéliales et avec celui des cellules myoblastiques entre elles. La connaissance de ce mécanisme permettrait donc d’améliorer le diagnostic des stérilités inexpliquées, de concevoir de nouvelles formes de contraception, mais aussi de comprendre d’autres phénomènes de fusion. Sur la base de nombreux travaux impliquant peptides, anticorps et protéines recombinantes, l’intégrine a6b1 a été identifiée comme le récepteur ovocytaire de la fertiline b ( ADAM2 ) spermatique (Almeida et al., 1995; Takahashi et al., 2000) . Cependant, des tests d’inhibition menés sur des ovocytes dépellucidés, ainsi que des expériences de délétion de gènes sont venus remettre en question cette donnée. En effet, les ovocytes invalidés pour les sous-unités a6 ou b1 des intégrines sont fécondables et les souris dont les cellules germinales sont mutées pour la sous-unité b1 des intégrines sont fertiles (Miller et al., 2000  ; He et al., 2003) . La disparité de ces résultats pourrait s’expliquer par la présence éventuelle de l’intégrine a 6 b 1, également, sur le spermatozoïde de souris. Cependant, aucune étude n’a fait référence à cette hypothèse malgré la présence de l’intégrine a6b1 sur le spermatozoïde humain.

Nous avons recherché cette intégrine sur le spermatozoïde de souris et vérifié son implication dans la fusion gamétique. Nous avons, ainsi, montré en immunofluorescence que les sous-unités a6 et b1 des intégrines sont effectivement présentes à la surface du spermatozoïde de souris. Lors de fécondation in vitro (FIV) en cumulus intact, les anticorps monoclonaux anti- a6 et anti- b1 inhibent effectivement la fusion des gamètes, mais cet effet inhibiteur n’est pas retrouvé sur des ovocytes dépellucidés. Cela suggère que l’intégrine a6b1 , se redistribuant en patches à la surface de l’ovocyte, sous l’effet de la dépellucidation, est court-circuitée lors de FIV avec des ovocytes dépellucidés. Enfin, le ligand potentiel de l’intégrine a6b1 , la protéine ADAM2, est présent à la surface de l’ovocyte de souris.

Ainsi, la fertilité des souris femelles dont les ovocytes ont été délétés pour la sous-unité b1 des intégrines pourrait s’expliquer par le fait que ces souris ont été croisées avec des mâles sauvages. En effet, les cellules de la lignée myoblastique délétées pour la sous-unité b 1 des intégrines ne fusionnent pas entre elles alors qu’elles le font avec des myoblastes sauvages (Schwander et al., 2003) . Ce phénomène suggère que la présence de la sous-unité intégrine b1 sur une des deux membranes est suffisante pour que la fusion ait lieu. Nous formulons donc l’hypothèse selon laquelle il en est de même pour les gamètes. L’invalidation du gène de la sous-unité b1 des intégrines sur les deux lignées germinales permettra de vérifier cette hypothèse. Cette expérimentation est en cours d’évaluation. Si cette hypothèse s’avérait exacte, nous aurions une clé pour l’identification de toutes les molécules impliquées dans le complexe de fusion membranaire des gamètes.

Almeida, E. A., Huovila, A. P., Sutherland, A. E., Stephens, L. E., Calarco, P. G., Shaw, L. M., Mercurio, A. M., Sonnenberg, A., Primakoff, P., Myles, D. G. et al. (1995). Mouse egg integrin alpha 6 beta 1 functions as a sperm receptor. Cell 81, 1095-104.

He, Z. Y., Brakebusch, C., Fassler, R., Kreidberg, J. A., Primakoff, P. and Myles, D. G. (2003). None of the integrins known to be present on the mouse egg or to be ADAM receptors are essential for sperm-egg binding and fusion. Dev Biol 254, 226-37.

Miller, B. J., Georges-Labouesse, E., Primakoff, P. and Myles, D. G. (2000). Normal fertilization occurs with eggs lacking the integrin alpha6beta1 and is CD9-dependent. J Cell Biol 149, 1289-96.

Schwander, M., Leu, M., Stumm, M., Dorchies, O. M., Ruegg, U. T., Schittny, J. and Muller, U. (2003). Beta1 integrins regulate myoblast fusion and sarcomere assembly. Dev Cell 4, 673-85.

Takahashi, Y., Yamakawa, N., Matsumoto, K., Toyoda, Y., Furukawa, K. and Sato, E. (2000). Analysis of the role of egg integrins in sperm-egg binding and fusion. Mol Reprod Dev 56, 412-23.

Journées du Collège 2006 – Tours – 16-18 Mars – Distribution des facteurs de transcription Pax6, Dlx, Nkx2.1, Olf1 et du peptide MCH dans le diencéphale ventral de rat au cours du développement

Distribution des facteurs de transcription Pax6, Dlx, Nkx2.1, Olf1 et du peptide MCH dans le diencéphale ventral de rat au cours du développement – C. Amiot*, D. Colin, G. Bernard-Franchi, F. Poncet, D. Fellmann*, P.Y. Risold

Université de Franche-Comté, EA 3922, Faculté de Médecine et de Pharmacie,* Service de Génétique, Histologie, Biologie du Développement et de la Reproduction, CHU Saint-Jacques Place Saint-Jacques, 25030 Besançon cedex

Dans le diencéphale de rat adulte, les neurones producteurs de l’hormone de mélano-concentration (MCH ) sont souvent considérés comme exclusivement localisés dans l’hypothalamus latéral, pourtant leur distribution est plus complexe. L’analyse de leur ontogenèse montre qu’ils naissent de la même région du neuroépithélium germinatif en un pic très large du 10 ème au 16 ème jours de vie embryonnaire. Ainsi, ces observations anatomiques et ontogénétiques permettent de décrire une région située entre le fornix et le faisceau mamillo-thalamique, caractérisée par la distribution des péricaryons MCH et appelée « zone à MCH ». Cependant, le concept de « zone à MCH » s’accommode mal des frontières neuroanatomiques classiques et il est en contradiction avec l’hypothèse de neurogenèse de l’hypothalamus en trois vagues successives à l’origine respectivement des zones latérale, médiane et périventriculaire.

Cette étude visait à a rgumenter la spécificité de la mise en place de cette structure unique en confrontant la distribution des neurones à MCH aux territoires d’expression de certains gènes du développement impliqués dans la mise en place du diencéphale (Pax6, Nkx2.1, Dlx et Olf1).

Ce travail a été effectué sur des cerveaux d’embryons de rats au 13 ème et au 14 ème jours de vie embryonnaire. Les cerveaux, préalablement fixés dans du paraformaldéhyde à 1%, ont été congelés puis débités au cryostat selon un plan de coupe horizontal par rapport au prosencéphale. Des études d’immunohistochimie indirecte ont ensuite été réalisées avec des anticorps anti-MCH, -TH (Tyrosine Hydroxylase), -Pax6, -Nkx2.1, -Dlx, -Olf1, ainsi que des expériences d’hybridation in situ avec une sonde ARN complémentaire de l’ARN messager Olf1.

Les premiers neurones à MCH différenciés ont été observés dans une fine bande de tissu exprimant Nkx2.1 et Dlx, mais n’exprimant ni Pax6, ni Olf1. Ce territoire était également caractérisé par le passage des premiers axones TH-positifs, issus des neurones dopaminergiques mésencéphaliques.

Ces résultats préliminaires suggèrent que la « zone à MCH » naîtrait et se différencierait dans un territoire caractérisé par l’expression d’une combinaison de facteurs de transcription.

Nous poursuivons actuellement ce travail par l’analyse de l’expression de ces facteurs à des stades plus précoces et plus tardifs du développement embryonnaire, ainsi que par l’étude d’autres facteurs de transcription qui pourraient être plus spécifiques de cette région d’intérêt.

Journées du Collège 2006 – Tours – 16-18 Mars – Traceurs flurorescents et détection immunohistochimique

Traceurs flurorescents et détection immunohistochimique – Marie Laure Martin Negrier ,

Service d’Histologie, Embryologie, UMR-CNRS 5541, Université Victor Segalen Bordeaux2, 146 Rue Léo Saignat,, 33076 Bordeaux Cedex

e-mail : mlmartin@u-bordeaux2.fr

Les traceurs fluorescents sont largement utilisés en biologie dans de nombreuses applications. Couplés à un anticorps, ils sont utilisés comme révélateur de réactions immunohistochimiques. Ils permettent d’obtenir des informations sur la localisation cellulaire et subcellulaire de protéines et d’étudier la dynamique de protéines. Un certain nombre de propriétés caractérise les fluorochromes : spectre d’excitation et d’émission, rendement quantique, coefficient d’extinction, durée de vie de la fluorescence, photostabilité. Le choix d’un fluorochrome doit répondre à certaines exigences comme l’obtention d’un marquage spécifique, durable, fort et respecter des fonctions cellulaires pour les études sur cellules vivantes. Ce choix sera guidé par un certain nombre de paramètres : équipement disponible, spectre d’excitation et d’émission du ou des fluorochromes dans le cas de détection multiples. Des innovations fortes au cours de ces dernières années ont permis le développement de nombreux marqueurs plus brillants et plus stables avec des spectres d’émission et d’excitation plus étroits que les fluorochromes classiques telle que la fluorescéine. Ces nouveaux fluorochromes comprennent entre autres les gammes des Alexas et des Cyanines. Plus récemment encore sont apparus de nouveaux traceurs fluorescents constitués de nanocristaux semi-conducteurs : les Quantums Dots. Leur intérêt réside dans un très large spectre d’absorption, un coefficient d’extinction élevé couplé à un spectre d’émission étroit. Ces Q-Dots, en blanchissant 10 2 à 10 3 fois moins que les fluorochromes classiques les rendent très performants pour des études dynamiques de suivi de particules uniques sur cellules vivantes.

Journées du Collège 2006 – Tours – 16-18 Mars – Communications

  Conférences

  • Traceurs flurorescents et détection immunohistochimique. M.L. MARTIN-NÉGRIER
  • Les cellules de souris transgéniques Gfp+, un outil pour le traçage des greffes in vivo et in vitro dans le cerveau ou pour suivre les potentialités de différenciation des cellules de la   moelle osseuse. D. FELLMANN – F. CHRÉTIEN
  • DiI et DiO, colorants membranaires permettant le traçage des voies axonales. M. CATALA
  • Injecter le cytoplasme d’une cellule par un dextran fluorescent, l’exemple du LRD. M. CATALA
  • Une brève histoire de l’embryologie, Martin CATALA, Paris
  • La Synapse par Jacqueline TROUILLAS, Lyon  (1ère partie, 2ème partie)
  • La Synapse par Bertrand BLOCH, Bordeaux
  • La maladie d’Alzheimer : un siècle après son identification,  André DEFOSSEZ et Claude Alain MAURAGE, Lille
  • La Fécondation,  Bertrand MACÉ, Rouen

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Journées du Collège 2006 – Tours – 16-18 Mars – CR Assemblée Générale

L’assemblée générale du Collège s’est tenue à la fin des Journées de Tours.

Bilan moral : Le président a tout d’abord rendu hommage au Doyen Georges Grignon décédé en aout dernier et chacun s’est recueilli quelques instants. Claude Caratéro nous a ensuite fait part de son départ à la retraite en septembre prochain et a proposé que l’un des vice-présidents, le Professeur Bertrand Macé, assure l’intérim jusqu’aux prochaines élections. Cette proposition sera soumise au vote lors de la prochaine réunion du Conseil d’administration qui devrait se tenir à Paris en Juin 2006.

Il a ensuite rappelé le fonctionnement du bureau du collège, le rôle du Président et ses relations avec le CNU. Il a également indiqué la tenue d’élections pour assurer le renouvellement de certains membres du CNU en septembre prochain et la tenue d’élections pour assurer le renouvellement du conseil d’administration du Collège lors des XIIemes journées.

Bilan financier : Odile Lacroix, qui assure les fonctions de Trésorière, en raison de la démission d’Eric Jullian, nous fait le bilan financier de 2005 : grâce à l’apport des membres partenaires, le solde au 31 décembre 2005 est positif. Le montant des cotisations reste identique (30 € pour les MCU PH et 50 € pour les PU PH) et un appel à réglement est fait. Ce bilan est approuvé à l’unanimité.

Les prochaines élections du CNU : Le président du CNU a donné les noms des membres sortants : Nelly Boehm, André Defossez et Pierre Jouannet pour les rangs A et Marie Françoise Chrétien, Michèle Cottier et Louise Telvi ainsi que Hélène Trouette, cooptée au moment de la nomination d’Henri Copin, pour les rangs B. Une discussion s’engage notamment sur l’équilibre entre les fonctions hospitalières : la Biologie de la Reproduction et la Cytogénétique doivent être représentées, sur l’équilibre entre la représentation de Paris et de la Province. Il est également fait la proposition d’une profession de foi des candidats qui doivent annoncer leur projet s’ils sont élus.

Questions diverses : Bertrand Macé rapporte les propos qu’il a échangés avec Omnisciences qui voudrait faire un ouvrage collectif d’Histologie destiné aux étudiants de PCEM1. Il envoie un message à chacun afin de recenser les éventuels participants avant de donner une réponse définitive à l’éditeur.

Journées du Collège 2006 – Tours – 16-18 Mars

11e Journées du Collège Universitaire et Hospitalier
des Histologistes, Embryologistes, Cytologistes et Cytogénéticiens

16 – 18 mars 2006
Tours

Cette année, les journées du collège se sont déroulées à Tours au Novotel de Chambray les Tours et ont démarré dès le jeudi après midi par l’atelier pédagogique des jeunes non titulaires. Ensuite les structures tissulaires, cellulaires et moléculaires nous ont été montrées grâce aux fluorochromes avec notamment l’utilisation des souris gfp.

Durant ces deux journées, Bertrand Bloch nous a traité la synapse comme il le fait devant les étudiants de PCEM1, André Defossez et Claude Alain Maurage nous ont raconté la maladie d’Alzheimer et Bertrand Macé nous a fait vivre un enseignement de master sur la fécondation.

Ces journées ont également permis de mieux connaître les futurs Maîtres de Conférences et Professeurs de notre discipline :

Frank Pellestor (Montpellier), Carole Goumy et Andrei Tchirkov (Clermont Ferrand), candidats à un emploi de Maître de Conférence

Michèle Cottier (Saint Etienne), Monique Courtade (Toulouse) et Serge Romana (Paris), candidats à un poste de Professeur

Cette rencontre a aussi été l’occasion d’échanger sur les dispositions prises par les facultés pour l’enseignement de PCEM1, sur la place de l’Histologie, Embryologie et la Cytogénétique dans la recherche et d’engager une réflexion sur les prochaines élections du CNU.