Journées du Collège 2003 – Dourdan VIII – 20-22 Mars – La fécondation in vitro : de l’artisanat à la biothérapie du futur

La fécondation in vitro : de l’artisanat à la biothérapie du futur
Jean Philippe Wolf*

La Fécondation naturelle

C’est dans l’ampoule tubaire qu’a lieu la rencontre du spermatozoïde et de l’ovocyte. Pour qu’elle ait lieu le spermatozoïde doit migrer au travers des voies génitales féminines et l’ovocyte émis dans la cavité péritonéale doit passer dans le pavillon tubaire. Le spermatozoïde est haploïde mais pas encore l’ovocyte qui est bloqué en métaphase de seconde division de la méïose. De leur fusion résulte un zygote dont le patrimoine génétique provient pour moitié du père et moitié de la mère. Ses chromosomes sont 18 à 25 heures après la fécondation, contenus dans des pronoyaux (PN). La disparition de leurs membranes et la fusion des 2 lots chromosomiques qu’ils contiennent s’appelle la syngamie. C’est le moment où véritablement se constitue le patrimoine génétique du fœtus. La fécondation entraîne aussi une activation de l’ovocyte qui se traduit, entre autre, par le clivage du zygote. Ce clivage donne un embryon lequel passe par les stades de morula, morula compactée et blastocyste pendant les 6 jours de sa migration tubaire jusqu’à la cavité utérine. Ce développement se fait à volume constant à l’intérieur de la zone pellucide, mais une fois dans la cavité utérine, l’expansion du blastocyste entraîne la rupture de cette dernière. Il éclot, et libéré dans la cavité utérine, peut perforer l’épithélium de surface de la muqueuse endométriale pour s’implanter dans le stroma de la muqueuse. C’est tout ces états successifs qu’il fallait pouvoir reproduire in vitro pour qu’une grossesse puisse être obtenue.

Louise Brown est née le 25 juillet 1978, il y a donc 25 ans. Sa naissance n’avait rien dû au hasard, mais résultait de la ténacité d’un biologiste le Dr Robert G Edwards. L’idée lui était venu dès les années 50 alors qu’il faisait son PhD à Edimbourg au cours duquel il a travaillé sur le modèle souris. C’est l’apparition des gonadotrophines d’origine urinaire qui fit réellement progresser la technique en permettant le recueil d’ovocytes en plus grand nombre. Il fallu pourtant de nombreuses années avant de résoudre le problème de la maturation in vitro de ces ovocytes dont on a longtemps cru qu’elle s’obtenait spontanément en 12 heures comme c’est le cas chez le lapin. Ce n’est qu’en 1966 au cours d’un stage post-doctoral au Johns Hopkins Hospital de Baltimore dans le service du Pr Howard Jones qu’une première tentative de fécondation in vitro d’ovocyte humain a été tenté et semble avoir réussi. Ignorant l’aspect des pronucleus normaux, les auteurs n’avaient revendiqué “qu’une première tentative” alors que les photos publiées semblent témoigner d’une fécondation effective. Rentré en Angleterre il fallu recommencer la quête des ovocytes humains pour reprendre les expériences de fécondation in vitro. C’est Patrick Steptoe, un gynécologue alors connu pour ses techniques de laparoscopie qui accepta de faire équipe avec lui pour ponctionner les ovaires après stimulation. Et c’est une lettre au Lancet daté du 12 Août 1978 qui annonça la nouvelle de la naissance du premier bébé fécondé in vitro. Il est difficile à imaginer aujourd’hui la réprobation qui entoura cette annonce et pour tout dire le scepticisme qu’elle entraîna quant à sa réalité.

La FIV

L’assistance médicale à la procréation était née. Bien que confidentielle au début elle est aujourd’hui mondialement utilisée pour venir en aide aux couples infertiles. D’abord réalisée pour les infertilités tubaires de la femme, elle s’est rapidement adressée aux autres infertilités et notamment celles d’origine masculine dues à des spermes altérés.

La technique consiste à incuber ovocytes et spermatozoïdes dans un milieu de culture compatible avec la survie des gamètes, la mobilité spermatique et la réaction acrosomique, la traversée de la zone pellucide et leur fusion. La mise au point de ces milieux de culture est assez complexe. Ils doivent en outre répondre à des critères de sécurité sanitaire édictés par l’AFSAP. Le succès ou l’échec de la tentative résulte de la succession d’une série d’actes de biologie entre la ponction ovocytaire et le transfert intra-utérin. Toutes des étapes sont décrites dans un cahier de procédure. La tache du biologiste consiste à s’assurer du respect des procédures à tout moment, de la parfaite traçabilité de tous les éléments cellulaires et réactifs de laboratoire et à anticiper tout événement intercurrent. Ce travail est en soi peu glorieux. Il se double d’une évaluation méthodique des résultats à toutes les étapes de la procédure pour détecter une éventuelle défaillance d’un réactif comme le milieu de culture ou d’un technicien.

La Biologie de la reproduction

Le travail du biologiste ne se limite toutefois pas à la parfaite réalisation des procédures de laboratoire. Son travail commence en amont et se trouve complémentaire de l’activité du Médecin de la reproduction. Ce dernier réalise l’évaluation de la fonction ovarienne et utérine de la patiente et assure la stimulation folliculaire jusqu’à la ponction ovarienne. Le biologiste assure le diagnostic de l’infertilité et l’évaluation des capacités fécondantes du sperme. Par ses investigations, il doit déterminer le caractère congénital ou acquis de l’infertilité. Selon les cas, il doit déterminer le caractère éventuellement transmissible de l’affection et réaliser un conseil génétique ou le caractère acquis et éventuellement curable de l’affection et alors procéder au traitement. Il est rare qu’une stérilité masculine soit curable. Cependant le traitement de toute cause d’altération des paramètres physiques et fonctionnels des spermes est susceptible d’améliorer la qualité des gamètes entrant dans la composition de l’embryon. Si les conditions de laboratoire sont strictement respectées, la qualité des gamètes et celle de l’embryon seront maintenues, mais il n’existe aujourd’hui aucun moyen de les améliorer. C’est pour cette raison qu’il est impératif de prendre soin des gamètes et de leur qualité bien avant la tentative de FIV. Le biologiste consulte donc les patients non par simple obligation administrative mais par nécessité.

Les techniques de fécondation assistée

Les techniques de fécondation assistée sont en fait très anciennes puisqu’elles ont été utilisées dans un premier temps dans un but de recherche fondamentale. Ainsi ont pu être mis en évidence l’absence de spécificité d’espèce dans les processus de décondensation de la tête spermatique à l’intérieur du cytoplasme ovocytaire. De même les deux fonctions du spermatozoïde avaient été entrevues. Il stocke d’un côté le génome d’origine paternelle et il assure la fécondation de l’ovocyte qui lui permet de l’apporter au sein du cytoplasme ovocytaire. Que le spermatozoïde ne soit pas fécondant importe peu à la qualité du génome qu’il transporte. Dès lors si une microinjection permet de le transférer dans un ovocyte les premières étapes de l’embryogenèse et notamment la décondensation du noyau peuvent s’effectuer normalement. Ainsi, que le spermatozoïde soit éjaculé, capacité ou non mobile ou non d’origine épididymaire voire même testiculaire ou d’une autre espèce, la microinjection permet d’obtenir des décondensations nucléaires et avec des gamètes de même espèce des embryons. Il est même possible de chauffer, voir de lyophiliser des spermatozoïdes et d’obtenir des embryons chez la souris en les microinjectant après réhydratation. La grande nouveauté des années 90 fut d’utiliser ces techniques dans un but de procréation et de mettre au point les techniques de fécondation assistée. Ces techniques sont apparentées à de la microchirurgie cellulaire et se regroupent avec la FIV sous le vocable de biologie interventionnelle. Le biologiste ne participe plus seulement à un diagnostic, mais devient le thérapeute essentiel puisque c’est lui qui réalise de geste permettant la “ création ” d’embryons.

  • La SUZI

La SUZI ou Sub Zonal Insemination consiste à faire passer un ou des spermatozoïdes dans l’espace périvitellin au contact même de la membrane ovocytaire. Dès lors c’est à un de ces spermatozoïdes de fusionner avec l’ovocyte pour le féconder. Cependant l’évaluation de cette technique a permis de montrer qu’il n’existe pas de blocage à la polyspermie au niveau de l’oolemme. Ainsi le nombre de spermatozoïdes à microinjecter était extrêmement difficile à déterminer en cherchant à éviter et l’échec de fécondation et la polyspermie. Un modèle mathématique calculant la probabilité de n’avoir qu’un seul spermatozoïde fécondant parmi n spermatozoïdes microinjectés a montré que le taux de fécondation diploïde ne pouvait pas dépasser 20 % environ ce qui s’est effectivement trouvé vérifié par l’expérience. Par contre le taux de fécondation à nombre de spermatozoïdes microinjectés égal était bien inférieur selon que les spermatozoïdes provenaient d’un sperme altéré ou normal, comme si la cellule portait le stigmate de son sperme d’origine. Comme nous le reverrons l’atteinte oxydative par les radicaux libres des spermes oligotératoasthénospermiques (OAT) peut vraisemblablement être à l’origine de ce phénomène.

  • L’ICSI

La microinjection intracytoplasmique résulte d’une erreur de manipulation, puisque c’est en voulant réaliser une SUZI qu’une pipette de microinjection est passée au travers de la membrane cytoplasmique de l’ovocyte pour déposer un spermatozoïde dans le cytoplasme. Comme nous l’avons vu cela suffit à assurer le développement embryonnaire mais la plus grande découverte de la microinjection intracytoplasmique ce fut la plasticité de la membrane cytoplasmique. Alors que l’angoisse du biologiste lors de la SUZI était de rompre accidentellement cette membrane, il s’est avéré que vouloir le faire volontairement est bien plus difficile qu’il n’y paraît et c’est la raison pour laquelle tant de tentatives préalables s’étaient soldées par des échecs. Les taux de fécondation post microinjection sont très élevés de l’ordre de 70 %. Cependant la qualité embryonnaire ne semble pas être aussi bonne qu’après une fécondation naturelle comme en témoigne leur plus grande fragilité lors de la congélation. Il n’est pas impossible que le court circuit de l’interaction membranaire ne perturbe les ondes calciques qui sont à l’origine de l’activation de l’ovocyte. Il a été montré que de telles perturbations sont susceptible d’altérer le développement embryonnaire.

La stimulation ovarienne

La maîtrise de la stimulation ovarienne a été la première clé de la fécondation in vitro. En effet lors de la première partie du cycle, dite folliculaire, il y a croissance des follicules à antrum puis sélection du follicule dominant. Les autres évoluent vers l’atrésie. La connaissance puis la maîtrise du mécanisme inducteur de l’ovulation a permis de programmer les tentatives pour pourvoir les réaliser dans des conditions de travail optimum pour les équipes des laboratoires. La maîtrise de l’extraction des gonadotrophines des urines des femmes ménopausées, outre la fortune de l’actuel détenteur de la coupe de l’América, a permis d’augmenter considérablement le pool des ovocytes récupérés pour la FIV en sauvant de l’atrésie une bonne partie des follicules à antrum. Plus récemment la connaissance et la synthèse des agonistes de la GnRH a permis d’éviter les interférences entre le cycle spontané et le cycle stimulé. De telles interférences étaient responsables de déclenchements prématurés du pic de LH et des ovulations ce qui avait pour conséquences la perte des ovocytes dans le péritoine. La ponction ovarienne elle même se fait actuellement sous échographie par voie vaginale et non plus par cœlioscopie qui entraînait une anesthésie complète pour la patiente.

Les progrès récent de la neuroendocrinologie et des mécanismes intra-ovariens de sortie des follicules du pool de réserve permettent une approche de la fécondité assistée pour des patientes présentant des insuffisances ovariennes précoces ou des syndromes de dysovulation.

Les co-cultures

Le développement embryonnaire in vitro est limité par la qualité des conditions d’incubation. Pendant longtemps il n’a pas été possible de dépasser le stade de 8 cellules obtenu à J3. C’est en 1995 que des embryons humains ont été cultivés sur des tapis de cellules Véro. Cette technique appelée co-culture a permis de dépasser ce blocage et d’obtenir des blastocystes in vitro. Il est probable que sur une cohorte embryonnaire seulement 20 à 30 % des embryons sont capables de soutenir le développement d’une grossesse jusqu’à son terme. La culture jusqu’au stade blastocyste aujourd’hui appelée culture prolongée permet de sélectionner les embryons ayant le meilleur potentiel de développement. Le taux d’implantation des blastocystes transférés à J6 est d’ailleurs bien supérieur à celui des embryons transférés à J2 ou J3. L’embryon a le meilleur potentiel de développement et présente une parfaite synchronie avec l’endomètre. Les cultures cellulaires ont été abandonnées du fait des risques sanitaires, mais des milieux de cultures entièrement synthétiques permettent ces cultures prolongées.

L’implantation

Le transfert intra-utérin de l’embryon à J2 ou J3 post ovulation résulte d’une anomalie. Normalement l’embryon n’y arrive qu’au stade blastocyste et 6 jours après l’ovulation. Il est probable d’ailleurs que l’implantation ne se fait pas de suite mais que l’utérus serve d’incubateur pour l’éclosion embryonnaire. Cependant le transfert des embryons congelés a montré l’existence d’une fenêtre d’implantation utérine située entre le 18 et le 22ème jour d’un cycle normal. En effet le transfert des embryons congelés se fait au cours de cycles non stimulés et à une date choisie par le clinicien sans autre contrainte. Les transferts plus précoces ou plus tardifs conduisent à des échecs. Depuis, il a été montré que cette fenêtre de transfert correspond à l’expression à la surface de l’épithélium de l’intégrine alpha6béta1 certainement nécessaire à l’interaction initiale entre l’embryon et l’endomètre.

La congélation embryonnaire

Les taux d’implantation embryonnaire se situent au environ de 20 %. Le transfert d’un seul embryon donne des taux de grossesse entre 15 et 20 % selon l’age des patientes et l’indication de l’AMP. Dans les meilleurs cas, il est même possible de faire des transferts mono-embryonaires. Cependant le plus souvent c’est 2 ou 3 embryons qui sont transférés à la fois. Bien sûr le taux de grossesses s’élève en même temps que celui des grossesses multiples. Une directive de la CNMBR a donc fixé à 2 le nombre d’embryons à transférer chez une femme de moins de 35 ans et à 3 au-delà. En effet, le transfert de 3 embryons ou plus entraîne 10 % de grossesses triples parmi celles qui sont obtenues chez les femmes de moins de 35 ans.

Pour éviter les grossesses multiples sans faire perdre de chances de grossesses aux patients, des techniques de congélation embryonnaires ont été mises au point. Ainsi deux frères ou sœurs conçus en même temps peuvent-ils naître à des années d’intervalle. Ces techniques de congélation donnent de bons résultats ce qui permet de procéder à de multiples transferts en évitant le risque de grossesses multiples

Les données de l’AMP aujourd’hui en France et dans le monde

Commencé dans la confidentialité il y a 25 ans, l’Assistance Médicale à la Procréation a permis la naissance de 100 000 enfants par an dans le monde et de 1,25 millions d’enfants au total depuis 1978. En France, il y a actuellement entre 43 et 45000 ponctions par an dont 50 % en moyenne correspondent à des techniques d’ICSI. En comptant les enfants obtenus lors des transferts d’embryons congelés, ce sont 10 à 11000 enfants qui naissent annuellement en France par AMP et 120 000 au total depuis le début de l’utilisation de ces techniques. Cela fait environ 1,25 % des naissances totales et 1,7 % si l’on y ajoute les enfants nés par les inséminations de sperme congelés (IAD). Ces techniques sont devenus incontournables et répondent à une augmentation de la prise en charge des couples infertiles. L’augmentation est due à une meilleure prise en charge de l’infertilité surtout masculine depuis l’introduction des techniques de fécondation assistée. Mais elle répond aussi à une augmentation bien réelle du pourcentage des couples infertiles dans la population. Aujourd’hui ce sont 15 % des couples en age de procréer qui sont amenés un jour à consulter pour un problème d’infertilité soit un couple sur 6 ce qui fait qu’il n’est quasiment plus possible de s’adresser à un auditoire sans que s’y trouve quelqu’un de personnellement concerné. Nous assistons de plus à une dégradation des paramètres spermatiques depuis une vingtaine d’années dans la population générale qui est suffisamment impressionnante pour que la Commission Européenne ait décidé d’y consacrer d’importants sommes en recherche .

Le cadre réglementaire de l’AMP

L’Assistance Médicale à la Procréation est une activité soumise à agrément. Celui-ci est donné par le Ministère de la Santé sur avis de la commission nationale de Biologie de la Reproduction et du Diagnostic Prénatal (CNMBRDP). Cet agrément est donné pour une personne, un lieu et par technique : assistance médicale à la procréation avec sperme de conjoint, sperme de donneur, pour la fécondation in vitro, sans ou avec micromanipulation etc. Un bilan annuel d’activité doit être remis au Ministère et le site est soumis à des visites de conformité par la DRAS et ou la CNAM au cours desquelles la tenue des dossiers aussi bien que les livres de procédure sont soumis à inspection. C’est donc une activité extrêmement encadrée.

Heureux qui comme Ulysse…

L’ampleur des découvertes et la mise au point des procédures de biotechnologie qu’il a fallu réalisées ont permis des progrès considérable dans la prise en charge des couples et en recherche fondamentale. Et les biologistes français ont de plus un motif de satisfaction dont peu se rendent compte. Ils ne travaillent pas sous la pression du Marché. Ils n’ont pas à être les meilleurs en taux de grossesses au risque de disparaître dans l’éventualité contraire. C’est le cas des pays où le système libérale de l’organisation de santé conduit les laboratoires à augmenter le nombre d’embryons lors des transferts pour obtenir la grossesse à tout prix au risque, bien sûr, des complications inhérentes aux grossesses multiples. Il n’est pourtant pas question de minimiser les problèmes graves qui se posent à la discipline. Par son objet même, la biologie de la Reproduction touche à une question extrêmement symbolique dans les mentalités puisqu’elle touche à la naissance et à la filiation. Il est faux de penser qu’il ne s’agirait que d’une médecine de luxe car la souffrance des couples qui ne peuvent procréer est comparable à celle d’un deuil de l’enfant à naître qui ne se termine jamais et d’autant moins que le caractère médiatique de la discipline ne permet guère d’y échapper. L’aspect spectaculaire est aussi mis en avant tellement les progrès ont été réalisés de façon rapide et décisive à la fois. La microinjection a permis de féconder des ovocytes à partir de spermatozoïdes isolés éventuellement ponctionnés directement dans le testicule alors que personne n’imaginait même avoir un jour une solution thérapeutique pour ces patients présentant des azoospermies sécrétoires. La rapidité des progrès pose d’ailleurs un problème très réel, celui de leur accompagnement par des règlements et des textes législatifs encadrant successivement, le problème de l’utilisation du sperme d’un homme décédé, celui de l’existence d’embryons congelés dont la loi ne précise pas ce qui doit en être fait, le problème de l’utilisation de gamètes immatures et ainsi de suite.

Il y a surtout une absence de politique cohérente d’évaluation des conséquences de ces techniques sur la qualité de l’embryon et de l’enfant à naître de la part des pouvoirs publics. Ainsi le Ministère, après s’être cru obligé de décerner simplement des décorations à ceux qui ont réalisé la première FIV en France, ne s’est préoccupé que de la distribution des agréments et de leur répartition pour organiser la carte sanitaire, mais n’a à aucun moment financer la moindre recherche sur la technique elle même. Pendant 20 ans les appels d’offres de l’INSERM concernant la biologie de la reproduction se sont faits à “l’exclusion de l’AMP” et ce n’est que l’an dernier que l’INSERM a enfin publié un appel d’offres encore bien modeste sur l’AMP. L’ouverture d’un grand nombre de centres de FIV privés fait que la plupart des tentatives réalisées en France y sont faites. Aux centres publics doit revenir la tache de développer les techniques et les investigations sur les enfants et la qualité embryonnaire mais là encore le manque de moyens et de volonté politique ne permet pas de s’acquitter de cette tâche.

L’avenir

La démographie de santé fait que cette discipline émergeante à de l’avenir. Mais il faut savoir ce que l’on veut en faire. Une médecine spectacle à but lucratif et ni le spectacle ni les marchands du temple ne manquent à l’appel ou une biologie clinique et interventionnelle appuyée sur des évidences expérimentales et une recherche fondamentale de qualité. Et les sujets ne manquent pas non plus.

- L’exploration du syndrome inflammatoire génital masculin et sa prévention qui pourra certainement prévenir un certains nombre d’infertilité masculine,

- L’étude de la qualité des gamètes et des embryons faisant appel à la biologie du développement pour savoir reconnaître quel est l’embryon à transférer qui donnera la grossesse,

- La congélation de fragments ovariens qui devrait permettre de préserver l’avenir génital des petites filles ou des jeunes femmes soumises à des traitements stérilisant pour des pathologies cancéreuses

- La compréhension des processus de la fusion gamétique dont on ne sait toujours pas comment elle a lieu mais dont on devine qu’elle présente quelques similitudes avec les processus de fusion virus cellules hôte,

- Les cellules souches humaines et le clonage thérapeutique dont on peut espérer des progrès thérapeutique considérables.

Voilà, brossés à grands traits, les problématiques et les challenges de la l’Assistance Médicale à la Procréation.